Uji Biokimia Mikroba

Metabolisme adalah semua reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi dan yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan-kegiatan selular, seperti pergerakan. Reaksi kimiawi yang membebaskan energi melalui perombakan nutrient disebut reaksi disimilasi atau penguraian; jadi merupakan kegiatan katabolik sel. Sedangkan reaksi kimiawi yang menggunakan energi untuk sintesis dan fungsi-fungsi sel lainnya disebut reaksi asimilasi atau anabolik. Jadi, reaksi disimilasi menghasilkan energi, dan reaksi asimilasi menggunakan energi. Bila sel merombak ikatan-ikatan kimiawi tertentu selama metabolisme, energi yang dilepaskan menjadi tersedia untuk melangsungkan kerja biologis. Selama masa hidup sel, kerja ini bersifat ekstensif dan beragam. Mikroorganisme heterotrofik nonfotosintesik memperoleh energinya dari oksidasi (pengusiran electron atau atom hydrogen) senyawa-senyawa anorganik.
Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup. Proses metabolisme dibedakan menjadi dua jenis yaitu anabolisme dan katabolisme. Anabolisme (Biosintesis) yaitu reaksi biokimia yang merakit molekul-molekul sederhana menjadi molekul-molekul yang lebih kompleks. Misalnya pembentukkan protein dari asam amino. Secara umum proses anabolik membutuhkan energi. Sedangkan katabolisme yaitu reaksi biokimia yang memecah atau menguraikan molekul-molekul kompleks menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana. Proses katabolik melepaskan energi yang dibutuhkan oleh sel.
Mikroorganisme memiliki fleksibilitas metabolisme yang tinggi karena mikroorganisme ini harus mempunyai kemampuan menyesuaikan diri yang besar sehingga apabila ada interaksi yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang tinggi pula. Akan tetapi karena ukurannya yang kecil, maka tidak ada tempat untuk menyimpan enzim-enzim yang telah dihasilkan. Dengan demikian enzim yang tidak diperlukan tidak akan disimpan dalam bentuk persediaan.enzim-enzim tertentu yang diperlukan untuk perngolahan bahan makanan akan diproduksi bila bahan makanan tersebut sudah ada.
Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tempat yang besar, mudah ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relative cepat. Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap mikroorganisme memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan maupun yang menguntungkan.
 Cara Bakteri Memperoleh Energi
Melalui proses Oksidasi-reduksi. Oksidasi adalah proses pelepasan electron sedang reduksi adalah proses penangkapan elektron. Karena elektron tidak dapat berada dalam bentuk bebas, maka setiap reaksi oksidasi selalu diiringi oleh reaksi reduksi. Hasil dari reaksi oksidasi dapat terbentuknya energi.
Pada umumnya reaksi oksidasi secara biologi dikatalisis oleh enzim dehidrogenase. Enzim tersebut memtransfer elektron dan proton yang dibebaskan kepada aseptor elektron intermedier seperti NAD+ dan NADP+ untuk dibentuk menjadi NADH dan NADPH. Fosforilasi oksidasi terjadi pada saat elektron yang mengandung energi tinggi tersebut ditranfer ke dalam serangkain transpor elektron sampai akhirnya ditangkap oleh oksigen atau oksidan anorganik lainnya sehingga oksigen akan tereduksi menjadi H2O.
1. Transfer elektron menuju oksigen melalui berbagai caier seperti flavoprotein,quinon maupun citekrom.
2. Adanya transfer elektron ini mengakibatkan aliran proton (H+) dari sitoplasma ke luar sel. Jadi arah aliran adalah dari dalam ke luar. Hal ini akan menimbulkan peredaan konsentrasi proton atau dikenal dengan gradien pH.
3. PH pada umunnya 7,5. Gradien pH terjadi jika pH di luar sel lebih kecil dari 7,5. Selanjutnya gradien pH bersama dengan potensial membentuk protonmotive force. Kekuatan (protonmotive force) inilah yang menarik proton dari luar sel kembali ke dalam sel. Bersamaan dengan masuknya kembali proton tadi terbentuk energi yang digunakan untuk berbagai aktifitas sel.
4. Para menbran terdapat enzim spesifik disebut dengan ATPase. Energi
yang disebabkan pada saat masuknya kembali proton tadi akan digunakan oleh ATPase untuk forforilasi ADP menjadi ATP. Energi ini disimpan dalam bentuk ikatan fosfat yang selanjutnya dapat digunakan untuk aktifitas sel. Reaksinya adalah:
Adenosin -P ~ P + Pi. ……energi…… Adenosin- P~ P~ P
 Ada dua macam energi yang digunakan oleh makhluk hidup.
1. Sinar matahari. Organismenya disebut dengan organisme fotosintesis atau di kenal juga dengan organisme fototrofik.
2. Oksidasi senyawa kimia. Organismenya disebut dengan organisme kemosintesis kemotrofik atau autotrofik.
 Fotosintesis ada dua macam
1. Fotosintesis tipe Cynobacteria. Fotosintesis tipe ini sama dengan fotosintesis yang terjadi pada tanaman tingkat tinggi dengan keseluruhan reaksi adalah.
CO2 + 2H2O ……sinar matahari…… H2O + [ CH2O ]n + O2 klorofil
Pada sistem fotosintesis ini terdapat 2 fotosistem yaitu fotosistem (PS) I dan II. Aliran elektron dari PS II ke PS I selanjutnya mengubah NADP+ menjadi NADPH. Aliran eletktron yang demikian dikatakan noncyelic phosphorilation.

2. Fotosintesis tipe Noncyanobacteria.
Kelompok bakteri ini tidak memiliki fotosistim II untuk menfotolisis H2O. Dengan demikian bakteri ini tidak pernah menggunakan air sebagai reduktan sehingga oksigen tidak pernah di hasilkan dari fotosintesis. Fotosintesis yang demikian berlangsung dalam keadaan anaerob, sehingga dikenal dengan fotosintesis anaerob. Jadi organisma ini memerlukan suplai senyawa organik sebagai donor hidrogennya Persamaan reaksi secara umum adalah:
Sinar matahari CO2 +2H2A……………………….H2O + [CH2O]n + 2A klorofil
 Respirasi Mikroba
Respirasi didefenisikan sebagai penggunaan serangkaian transfor elektron untuk mentransfer elektron menuju aseptor elektron terakhir. Energi diperoleh melalui fosporilasi oksidatif tetapi dalam prosesnya bisa menggunakan oksigen sebagai aseptor elektron terakhir (respirasi aerob) atau senyawa anorganik lain (resfirasi anaerob).
 Respirasi Aerob
Banyak organisme yangn mampu menggunakan oksigen sebagai aseptor elektron terakhir. Dalam hal ini tidak diperlukan reduksi senyawa intermediator sebagaimana dalam fermentasi. Hasilnya senyawa-senyawa intermediate tersebut dapat dioksidasi sempurna menjadi karbon dioksida dan air. Ini merupakan keuntungan yang sangat besar bagi organisme karena jumlah energi yang dihasilkan dari oksidasi sempurna satu molekul glukosa jauh lebih besar bila dibandingkan melalui fermentasi.
Hal ini disebabkan rangka aliran elektron dari NADH ke O2 melalui serangkaian karir Cytocrom menghasilkan 3 ATP. Energi tersebut, bersama dengan eneegi yang diperoleh dari oksidasi Virupat menjadi asetil COA menghasilkan 36 ATP yang dihasilkan dari metabolisma glukosa menjadi CO2 dan H2O. Jika kita bandingkan dengan dua ATP yang dibentuk dari satu molekul glukosa melalui fermentasi alkohol atau asam laktat, maka metabolisme aerob jauh lebih efesien dibanding dengan permentasi. Hal ini dipenuhi melalui proses degradasi disebut tricarboxylic Acid Cycle (TCA Cycle) atau dikenal dengan siklus asam sitrat maupun siklus Krebs. Setiap kali oksalo asetat bergabung dengan asetil COA yang berasal dari Piruvat masuk ke dalam siklus akan membentuk senyawa 6 karbon yang dikenal dengan asan sitrat sehingga dinamakan siklus asam sitrat. Dalam setiap putaran menghasilkan serangkaian oksidasi menyebabkan terjadinya reduksi NAD atau FAD dan membebaskan 2 molekul CO2. Jadi senyawa 6 karbon asam sitrat kembali ke bentuk semula yaitu senyawa 4 karbon oksalo asetat yang siap bergabung kembali dengan asetat / astil COA. Akhirnya semua senyawa NADH dan FADH mengalami posforilasi oksidatif dengan melepaskan elektron melalui serangkain cyticrom ke oksigen menghasilkan air dan 3 molekul ATP untuk setiap pasang elektron dari NADH.
 Respirasi Anaerob
Disamping metabolisma aerob, dan fermentasi terdapat metabolisma lain yang pada umumnya bersifat anaerob. Akan tetapi mikroorganisme tersebut tidak melakukan fermentasi. Bakteri tersebut menggunakan senyawa anorganik sebagai aseptor elektron terakhirnya. Organisma tersebut dapat dibagai dalam 3 kelompok yaitu : reduser sulfat, reduser nitrat dan bakteri metan. Yang perlu diingat bahwa, meskipun tipe metabolismenya adalah anaerob, elektron yang dibebaskan melalui reaksi oksidasi ditransfer melalui serangkaian transfer elektron dan energi dihasilkan melalui fosforilasi oksidatif. Letak perbedaan antara resfirasi aerob dan anaerob adalah bahwa pada respiriasi anaerob yang berperan sebagai aseptor elektron terkahir adalah senyawa anorganik, bukan oksigen.
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi.
Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain :
a. Indol
Tujuan
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam memecah asam amino triptofan.

Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber carbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.

b. MR-VP (Uji Voges Proskauer)
Tujuan
• Untuk menentukan mikroorganisme yang mampu meoksidasi glukosa dengan menghasilkan asam berkonsentrasi tinggi dan mempunyai stabilitas terhadap hasil akhir tsb.
• Untuk membedakan bakteri Escherichia coli dengan Enterobacter aerogenes.


1. Uji MR
Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran

2. Uji VP
Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin)

c. SIM

Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif, hal ini terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga terlihat ada warna hitam, yang berarti bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit (H2S)

d. Simmons Citrate
Tujuan
1)Membedakan bakteri usus berdasarkan kemampuan untuk memfermentasikan sitrat sebagai satu satunya sumber karbon.

Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel.

e. TSIA (Uji Triple sugar Iron agar)
Tujuan
1)Membedakan anggota Enterobacteriaceae
2)Membedakan Enterobacteriaceae dan kelompok lain dari basil usus.
Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa.

Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan Co2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe++ yang terdapat pada media dan menghasilkan endapan hitam.

Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Media ini biasanya digunakan untuk membedakan Salmonella dan Shigella dengan bakteri Gram negatif bentuk batang lainnya bedasarkan pola fermentasi penghasil hydrogen sulfide. Untuk pengamatan pola-pola pengunaan karbohidrat. TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan phenol red sebagai indicator yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakterinya


f. Uji gula-gula(Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas.

g. Uji oksidase
Tujuan
Menentukan bakteri yang mempunyai kemampuan sitokrom oksidase

h. Uji Katalase
Tujuan
1. Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan H2O2 oleh enzim katalase
2. untuk mengetahui adanya enzim katalase yang menguraikan hidrogen pperoksida menjadi Oksigen bebas

i. Uji Urease
Tujuan
1. Untuk menentukan mikroorganisme yang mampu menguraikan urea oleh enzim urease.
2. Untuk mengetahui peranan enzim urease dalam menguraikan urea menjadi amonia.

j. Uji reduksi Nitrat
Untuk menentukan kemampuan beberapa organisme dalam meredukasi nitrat menjadi nitrit atau di luar bentuk nitrit.

k. Uji Fermentasi karbohidrat
Bertujan untuk menguji kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa, xilosa, arabinosa dan Sukrosa.
l. Uji hidrolisis Pati
Mengetahui peranan enzim alfa amilase dalam menghidrolisis pati.
m. Uji Hidrolisis Lemak
Mengetahui peranan anzim lipase yang menghidrolisis lemak menjadi asam lemak.
n. Uji Hidrolisis Gelatin
Mengetahui adanya enzim gelatinase yang mampu mengidrolisis gelatin.